Реакция преципитации (иммунологический метод). Реакция преципитации. Области применения Метод преципитации

Реакция преципитации.

Реакция преципитации (РП)- ϶ᴛᴏ осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).

РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе . В судебной медицинœе ее используют для определœения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000.

Компоненты реакции преципитации.

1. Антиген (преципитиноген) - это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены - ϶ᴛᴏ различные лизаты или экстракты тканей и др.
Размещено на реф.рф
Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген имеет размеры клеток (это не разрушенные целые клетки), а размеры преципитиногена соизмеримы с размерами молекул (это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Раствор преципитиногена прозрачный.

2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.

3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Получение преципитиногена .

Получаютпутемизмельчения материала и извлечения из него белковых антигенов кипячением или другими способами.

Примеры преципитиногенов : лизаты или экстракты различных органов и тканей, чужеродная сыворотка крови (сыворотка - это раствор , в первую очередь, различных белков), фильтраты бульонных культур микробов, солевые экстракты микробов, аутолизаты и др.

Получение преципитирующих сывороток.

Получают путем гипериммунизации кроликов соответствующими преципитиногенами. Такие сыворотки содержат антитела к тем преципитиногенам, которыми иммунизировали кроликов.

Примеры преципитирующих сывороток : преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (содержит антитела к антигенам возбудителя сибирской язвы), преципитирующая противоменингококковая сыворотка (содержит антитела против антигенов возбудителя менингита) и др.

Титр преципитирующей сыворотки - ϶ᴛᴏ наибольшее разведение преципитиногена, при котором сыворотка еще дает реакцию преципитации.

Способы постановки РП.

1. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Далее осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально.

Учёт результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.

В случае если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция принято называть реакцией термокольцепреципитации (к примеру, при диагностике сибирской язвы).

2. Реакция преципитации в гелœе – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в гелœе:

а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии : один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата ;

б) метод двойной иммунодиффузии : и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом гелœе навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации .

Примером РП в гелœе являетсяреакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагностике дифтерии

Иммуноэлектрофорез – это метод, который сочетает метод электрофореза и реакцию преципитации. Смесь антигенов (к примеру, белков сыворотки крови) разделяется в гелœе при помощи электрофореза. Затем, чтобы найти и определить нужный белок (неизвестный антиген), используют диагностическую преципитирующую сыворотку, которая содержит антитела к этому белку (известное антитело). Для этого в канавку параллельно белкам вносится диагностическая сыворотка. В случае если среди белков имеется тот, который соответствует антителу, находящемуся в сыворотке, то вокруг него образуются линии преципитации .

Реакция преципитации. - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Реакция преципитации." 2017, 2018.

ПРЕЦИПИТАЦИЯ (лат. praecipitatio стремительное падение) - иммунологическая реакция осаждения из раствора комплекса антиген-антитело, образующегося в результате соединения растворимого антигена (преципитиногена) со специфическими антителами (преципитинами).

Реакцию П. широко используют для идентификации и количественного определения самых разнообразных антигенов и антител (см. Иммунодиагностика), при серодиагностике инф. болезней (см. Серологические исследования), для обнаружения примесей в пищевых продуктах, при изучении эволюционных взаимосвязей в животном и растительном мире, при исследовании структуры различных биол, соединений, в судебной медицине для определения видовой принадлежности пятен крови и других биол, жидкостей.

П. открыта в 1897 т. Краусом (R. Kraus), наблюдавшим выпадение осадка (преципитата) при смешивании бесклеточных прозрачных фильтратов бульонных культур бактерий чумы, холеры, тифа с гомологичными иммунными сыворотками. В 1899 г. Ф. Я. Чистович, иммунизируя кроликов сывороткой угря, получил преципитирующие антитела и тем самым впервые продемонстрировал видовую специфичность белков сыворотки крови. Применение П. в суд.-мед. экспертизе для определения видовой принадлежности крови было предложено в 1901 г. П. Уленгутом. Реакция получила название реакции Чистовича - Уленгута. Впоследствии было показано, что преципитирующие антитела (см.) образуются у представителей различных видов позвоночных к любым чужеродным высокомолекулярным веществам (см. Антигены ). Преципитирующие антитела принадлежат к иммуноглобулинам класов G и M (см. Иммуноглобулины). Скорость и интенсивность биосинтеза преципитирующих антител определяются рядом факторов: дозой и путем введения антигена, схемой иммунизации, особенностями хим. структуры антигена и генетическими особенностями иммунизируемого организма.

Для получения преципитирующих сывороток используют различные схемы иммунизации. Хорошие результаты дают схемы из нескольких циклов иммунизации, каждый из которых включает несколько внутривенных или внутримышечных инъекций антигена в возрастающих количествах. В 1915 г. М. И. Райский предложил схему, состоящую из первичной иммунизации и отдаленной реиммунизации. На этом принципе основано получение преципитирующих сывороток высокого титра. Первичную иммунизацию принято проводить антигеном в смеси с каким-либо депонирующим веществом (ланолином, минеральным маслом, алюмокалиевыми квасцами и др.), усиливающим иммунный ответ, а отдаленную реиммунизацию - только антигеном. Широко применяют в качестве депонирующего вещества адъювант (усилитель) Фрейнда, состоящий из смеси минеральных масел и убитых микобактерий туберкулеза (см. Адъюванты).

Раствор антигена, эмульгированный в равном объеме адъюванта Фрейнда, вводят экспериментальным животным подкожно или внутримышечно в несколько точек спины либо в подушечки задних лапок или в подколенные лимф. узлы задних конечностей. В некоторых схемах используют комбинации перечисленных способов введения. Через месяц животным вводят р-р антигена внутривенно или внутримышечно. При необходимости перед реиммунизацией проводят гипосенсибилизацию по Безредке (см. Безредки методы). При незначительном расходе антигена (1-3 мг для белковых антигенов на курс иммунизации) количество образующихся антител достигает нескольких миллиграммов в 1 мл иммунной сыворотки.

Для реакции преципитации характерна высокая специфичность. В серии работ К. Ландштейнера с антисыворотками к конъюгированным антигенам, в качестве детерминантных групп которых выступали различные органические радикалы, было продемонстрировано, что в реакции П. можно дифференцировать стереоизомеры органических соединений. Сила наблюдающихся перекрестных реакций определяется близостью хим. структуры детерминантных групп иммуноантигенов и тест-антигенов. В состав преципитата входят антигены и специфичные к ним антитела и практически не включаются другие белки сыворотки крови, кроме комплемента.

П.- высокочувствительная реакция. С ее помощью могут быть обнаружены десятые доли микрограмма антигена. При определении антител порог чувствительности реакции составляет ок. 20 мкг белка. Чувствительность реакции значительно повышается, если применяют антигены или антитела, меченные радиоактивными изотопами (см.).

Постановка реакции

При постановке реакции преципитации необходимо учитывать ее зональный характер, который выражается в том, что молекулярный состав и количество образующегося преципитата определяются соотношением введенных в реакцию антигена и антител (см. Антиген - антитело реакция). При использовании постоянного количества антисыворотки и возрастающих количеств антигена количество преципитата в ряду пробирок вначале увеличивается, достигает максимума, а затем уменьшается вплоть до полного исчезновения. В надосадочной жидкости первых пробирок обнаруживают свободные антитела (зона избытка антител), в жидкости над максимальным преципитатом не содержатся ни свободные антитела, ни свободный антиген (зона эквивалентности), в надосадочной жидкости последних пробирок находят растворимые иммунные комплексы и свободный антиген (зона избытка антигена). Образование растворимых иммунных комплексов с небольшим молекулярным весом в зоне избытка антигена характерно для всех преципитирующих систем, антитела в которых принадлежат к IgG. Эта зона реакции названа поэтому зоной задержки, или постзоной. Следует отметить, что иммунные комплексы антигенов с IgM-антителами нерастворимы в очень большом избытке антигена, в десятки раз превышающем его количество, достаточное для образования растворимых иммунных комплексов с IgG-антителами.

Для лошадиных противобелковых сывороток характерно образование растворимых иммунных комплексов и в зоне избытка антител, т. е. образование прозоны (см. Нейссера-Вексберга феномен). Эту особенность реакции впервые обнаружил Г. Рамон в системе дифтерийный токсин - антитоксическая лошадиная сыворотка (см. Флоккуляция). Растворение иммунных комплексов в зоне избытка антител наблюдали впоследствии при проведении П. с кроличьими и собачьими сыворотками крови против бычьего сывороточного альбумина, с человеческой сывороткой крови против тиреоглобулина, овечьей антисывороткой против синтетических полипептидов.

Молекулярный состав преципитата определяется также мол. весом (массой) антигена. Для яичного альбумина, мол. вес к-рого 42 000 дальтон, в зоне эквивалентности на одну молекулу антигена приходится в среднем 2,5 молекулы антител. С увеличением мол. веса антигена число молекул антител, связываемых одной молекулой антигена, увеличивается.

П. используют для качественного и количественного определения антигенов и антител. Быстрый, простой и чувствительный качественный метод П.- кольцепреципитация, предложенная в 1902 г. Асколи. Кольцепреципитацию применяют для идентификации растворимых антигенов микроорганизмов. Реакцию выполняют в узких пробирках или капиллярах, осторожно наслаивая р-р антигена на иммунную сыворотку. При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется кольцо преципитации. На результат реакции не влияет избыток антигена благодаря постепенной диффузии реагентов к границе жидкостей. Если в качестве антигенов используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то реакция носит название «термопреципитация» (см. Асколи реакция). С помощью термопреципитации обнаруживают термостабильные бактериальные антигены (коктоантигены) в тканях и органах погибших животных при диагностике чумы, холеры, сибирской язвы. Кольцепреципитацию и термопреципитацию выполняют с антисыворотками высокого титра.

К полуколичественным методам П. могут быть отнесены методы оценки силы сывороток и количества антигенов по их предельному разведению, дающему еще видимую П. со стандартным антигеном или анти-сывороткой, и методы оптимальных пропорций.

При титровании сывороток по предельному разведению необходимо подбирать такое количество антигена, чтобы не попасть в зону задержки. Поэтому предварительно определяют наименьшее разведение тест-антигена, при к-ром происходит реакция с заведомо положительной сывороткой. Это рабочее разведение (дозу) антигена используют для определения предельного разведения (титра) испытуемых сывороток. Сравнительное титрование антигена методом предельных разведений можно проводить без предварительного подбора рабочей дозы сыворотки, если она содержит антитела преципитирующего, но не флоккулирующего типа.

Метод оптимальных пропорций основан на определении точки эквивалентности серол. системы по инициальной И. и на том наблюдении, что точка эквивалентности в каждой серол. системе возникает при определенном отношении антитела к антигену. Поэтому при титровании сывороток, определив по быстроте П. количество стандартного антигена, соответствующее точке эквивалентности, можно выразить ее активность в любых условных биол. единицах, если в предварительном титровании с сывороткой известной силы установлено, скольким ее единицам эквивалентен стандартный антиген. Аналогичные расчеты проводят при титровании антигена со стандартной сывороткой. Метод оптимальных пропорций может быть выполнен в a-варианте, предложенном Дином и Уэббом (H. Dean, R. Webb, 1928),- с постоянным объемом сыворотки и возрастающими разведениями антигена и в ß-варианте, предложенном Г. Рамоном (1922),- с постоянным объемом антигена и возрастающими разведениями сыворотки.

Количественный метод определения антител в весовых единицах, предложенный в 1933 г. Гейдельбергером (М. Heidelberger) и Кендаллом (F. Е. Kendall), основан на том, что в зоне эквивалентности из раствора в осадок выпадают практически весь антиген и все антитела. Определив любым хим. методом количество белка преципитата в этой точке и вычтя из него количество прибавленного в пробу антигена, рассчитывают количество белка в осадке, приходящееся на долю антител.

При постановке П. любым из описанных методов следует работать с хорошо отцентрифугированными р-рами антигенов и сывороток. Реакция должна сопровождаться контролем: иммунная сыворотка + изотонический р-р хлорида натрия, нормальная сыворотка + антиген, гетерологическая сыворотка + антиген. Следует предотвращать возможность бактериального загрязнения, выполняя П. в стерильных условиях или применяя консерванты типа мертиолата, амида натрия. Реакцию выполняют при физиол. концентрации соли (0,15 М раствор хлорида натрия), в диапазоне pH 6,5-8,0.

Определение индивидуальных антигенов, находящихся в смеси с другими веществами, возможно в реакции П. только при использовании моноспецифических сывороток. Специфические антитела в сыворотках могут быть идентифицированы, если П. выполняют с индивидуальными антигенами. Для анализа, характеристики и сравнения многокомпонентных систем антиген - антитело без их предварительного фракционирования используют методы, основанные на проведении П. в геле, в частности метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню (см. Иммунодиффузия) .

П.- двухфазная реакция. Фазы реакции отличаются по механизму и скорости протекания (см. Антиген-антитело реакция). Следует учитывать, что на вторую фазу реакции - собственно образование преципитата - оказывает влияние ряд неспецифических факторов: концентрация в растворе солей и водородных ионов, температура, объем реагентов. При увеличении концентрации солей выше физиол, значения (0,15 М) количество образующегося преципитата уменьшается. В 15% р-ре хлорида натрия преципитаты, образованные полисахаридными антигенами, диссоциируют. Изменение концентрации водородных ионов в физиол. пределах pH (от 6,5 до 8,0) заметно не влияет на формирование преципитата. При снижении pH раствора до 5,0 или повышении до 9,0 существенно уменьшается количество образующегося преципитата, а при pH ниже 3,0 и выше 11,0 ранее образованные преципитаты диссоциируют. На свойстве преципитатов диссоциировать в крепких солевых р-рах и при крайних значениях pH основаны методы выделения чистых антител и антигенов из специфических преципитатов. Наиболее употребляемые диссоциирующие агенты - концентрированные р-ры нейтральных солей, разбавленные к-ты и щелочи, концентрированные р-ры амидов, полианионы.

Преципитация в судебно-медицинском отношении

В судебной медицине П. применяют для дифференцирования крови человека и животных (см. Кровь). Наибольшее распространение получила кольцепреципитация, но она не пригодна для исследования мутных р-ров антигена и подвержена неспецифическим влияниям загрязнений объекта экспертизы. Этих недостатков лишена П. в агаровом геле, однако она требует длительных сроков наблюдения и менее чувствительна. Внедряют в практику электропреципитацию, или встречный иммуноэлектрофорез (см.), сочетающий достоинства П. в агаре с высокой чувствительностью и быстротой проведения реакции. Все варианты П. осуществляют с иммунными сыворотками (см.), преципитирующими белки человека, собаки, лошади и др. Они должны быть активны и специфичны, т. е. вызывать П. гомологичного антигена (напр., соответствующей нормальной сыворотки крови человека пли животного) и не образовывать преципитата с гетерологичными (чужеродными) антигенами.

Из исследуемых пятен крови готовят вытяжки и разводят их до необходимой концентрации белка. Для П. в агаре можно брать вырезки (вытяжки) из пятен и проводить реакцию с несколькими преципитирующими сыворотками. Параллельно испытывают контрольные участки предмета - носителя пятен, которые не должны вызывать П. При положительном результате с пятном крови и преципитирующей сывороткой делают вывод о видовой принадлежности крови, напр. кровь человека, собаки и др. При этом нельзя точно установить происхождение крови, если она принадлежит близкородственным животным (напр., кровь собаки или волка). Отрицательный результат при наличии в вытяжке белка свидетельствует о принадлежности крови животному, белок к-рого не выявляется с помощью обычного набора преципитирующих сывороток. Если в вытяжке не установлен белок, то принимают во внимание лишь положительный результат, т. к. отсутствие преципитата можно объяснить недостаточным количеством белка в вытяжке.

Библиография: Бойд У. Основы иммунологии, пер. с англ., с. 314, М., 1969; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., с. 8 и др., М., 1968; Райски й М. Быстрое получение крепких преципитинов, Харьковск. мед. журн.,т. 20, № 8, с. 135, 1915; он же, Повторная иммунизация, как метод получения преципитирующих сывороток, там же, с. 142; он же, Как долго сохраняются в крови иммунизированного животного крепкие преципитины, там же, № 9, с. 161; он же, Как нужно иммунизировать, чтобы животное устойчиво и длительно сохраняло в крови крепкие преципитины, там же, с. 169; Туманов А. К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств^ с. 57,М., 1975; Чарный В. И. Установление видовой специфичности белков крови, М., 1976; Чистович Ф. Я. Изменения свойств крови при впрыскивании инородной сыворотки и крови, в связи с теорией иммунитета Ehrlich’a, Рус. арх. патол., клин, мед. и бакт., т. 8, в. 1, с. 21, 1899; С а г-р enter Ph. L. Immunology and serology, Philadelphia, 1975; Methods in immunology and immunochemistry, ed. by C. A. Williams a. M. W. Chase, v. 3, N. Y.- L., 1971.

И. А. Тарханова; В. И. Чарный (суд.).

Реакция преципитации (РП)– это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).

РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе . В судебной медицине ее используют для определения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000.

Компоненты реакции преципитации.

1. Антиген (преципитиноген) - это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены – это различные лизаты или экстракты тканей и др. Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген имеет размеры клеток (это не разрушенные целые клетки), а размеры преципитиногена соизмеримы с размерами молекул (это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Раствор преципитиногена прозрачный.

2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.

3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Получение преципитиногена .

Получаютпутемизмельчения материала и извлечения из него белковых антигенов кипячением или другими способами.

Примеры преципитиногенов : лизаты или экстракты различных органов и тканей, чужеродная сыворотка крови (сыворотка - это раствор , в первую очередь, различных белков), фильтраты бульонных культур микробов, солевые экстракты микробов, аутолизаты и др.

Получение преципитирующих сывороток.

Получают путем гипериммунизации кроликов соответствующими преципитиногенами. Такие сыворотки содержат антитела к тем преципитиногенам, которыми иммунизировали кроликов.

Примеры преципитирующих сывороток : преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (содержит антитела к антигенам возбудителя сибирской язвы), преципитирующая противоменингококковая сыворотка (содержит антитела против антигенов возбудителя менингита) и др.

Титр преципитирующей сыворотки – это наибольшее разведение преципитиногена, при котором сыворотка еще дает реакцию преципитации.

Способы постановки РП.

1. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально.

Учет результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.

Если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция называется реакцией термокольцепреципитации (например, при диагностике сибирской язвы).

2. Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле:

а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии : один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата ;

б) метод двойной иммунодиффузии : и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации .

Примером РП в геле являетсяреакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагностике дифтерии

Иммуноэлектрофорез – это метод, который сочетает метод электрофореза и реакцию преципитации. Смесь антигенов (например, белков сыворотки крови) разделяется в геле при помощи электрофореза. Затем, чтобы найти и определить нужный белок (неизвестный антиген), используют диагностическую преципитирующую сыворотку, которая содержит антитела к этому белку (известное антитело). Для этого в канавку параллельно белкам вносится диагностическая сыворотка. Если среди белков имеется тот, который соответствует антителу, находящемуся в сыворотке, то вокруг него образуются линии преципитации .

/ 34
ХудшийЛучший

В основе реакций преципитации лежит образование и выпадение в осадок комплексов антиген-антитело. В реакции участвуют растворимые антигены: преципитиногены (продукты микроорганизмов, тканей, химические вещества и лекарства). Антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами, вызывают их агрегацию, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата). Диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром антител. Их получают путем иммунизации лабораторных животных соответствующим антигеном. Титром преципитирующей сыворотки является минимальное количество антигена, которое данная сыворотка может преципитировать.

Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и плотной среде (в агаре или геле).

Реакция преципитации в жидкой среде (кольцепреципитация). Реакцию ставят в узких пробирках, куда вносят преципитирующую антисыворотку, а сверху осторожно наслаивают прозрачный раствор антигена. При положительной реакции через несколько минут на границе соприкосновения двух жидкостей появится кольцо преципитации. При малых количествах реагентов реакцию можно проводить в капиллярах (микропреципитация).

Реакция преципитации в агаре. Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки в агаре, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации.

Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони. Реакцию проводят на пластинках с агаровым гелем. Растворы антигена и антисыворотки помещают в лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. Иммунореагенты диффундируют в геле, при встрече образуют комплексы, которые осаждаются в виде линий преципитации. Этот метод позволяет исследовать сразу несколько образцов иммунореагентов. Например, вокруг лунки с антисывороткой можно разместить несколько лунок с растворами разных антигенов или наоборот.

Метод определения токсигенности микробов в реакции преципитации. Принцип иммунодиффузии в геле положен в основу метода, который применяется для изучения токсигенности (способности вырабатывать токсин) бактерий. Например, для обнаружения дифтерийного токсина на чашку Петри с агаром посередине накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической сывороткой. Рядом засевают исследуемые культуры бактерий. Если они выделяют токсин, то при взаимодействии с антитоксинами между колониями и полоской бумаги образуются линии преципитации.

Иммунодиффузия в геле лежит в основе реакции преципитации по Манчини, которая используется для определения классов иммуноглобулинов в сыворотке крови (см. иммуноглобулины).

Реакции преципитации используются для; определения антигенов бактерий, тканей человека и животных; диагностики некоторых инфекционных заболеваний; определения видовой принадлежности белка в судебной медицине; выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях в санитарной практике.

Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.

Механизм. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата -помутнение.

Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в"вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.

15. Реакция с участием комплемента: реакция гемолиза, реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, применение.

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным.

Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О.Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент

комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.

Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.

В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.

Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан-тиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана)